血液總RNA提取試劑程序
描述:血液總RNA提取試劑特別加強了對液體標本如全血等RNA的提取能力。直接將液體標本與血液總RNA提取試劑混合即可,極大簡化了樣品的提取前處理過程。并且其提取能力強大,甚至可以從已經凝固的血液塊中提取出高純度的RNA。使用方法與RNAtrip 和TRIzol相似,可在30-60分鐘內完成。獲得的高純度總RNA可用于RT-PCR、Northern Blot、RNA酶保護、Poly(A) mRNA純化、體外翻譯等實驗。
儲存:4oC密封避光保存一年以上有效。
適用:液體標本(200µl/ml): 全血、體液、尿液,懸浮細胞、病毒微生物樣品等。
RNA提取程序
液體標本:全血、體液、尿液,懸浮細胞、病毒微生物樣品等。每200ml液體樣品加1 ml RNAtrip LS,置冰上。未抗凝的凝固血液按固體組織處理。
1. 將裂解物轉移到1.5 ml離心管,置冰上10分鐘。如需暫停操作,裂解物可凍存于-70 oC至少一個月。
2. 加入0.2體積的氯仿(0.2ml),充分顛倒混勻,冰上孵育1-5 分鐘,溶液開始分相。有時分相不明顯,不影響提取。
離心12,000g 4 oC 10 分鐘,溶液分為兩相。RNA保留于上層無色透明水相約0.6ml,下層為有機相,兩相界面是一層薄膜其厚度與組織細胞類型和多少有關。小心吸出上層水相轉移到新離心管,但應留0.5-1 mm厚水相,以免擾動和吸入下面的碎片和無機相。如吸入無機相和碎片,應將所取水相放回管中并重新離心10分鐘,再吸取水相。這一點至關重要,違背此原則容易導致RNA降解和DNA污染。
3. 加入等體積異丙醇(0.5ml)于含有上清的新離心管中,充分混勻。冰上孵育10 分鐘綽綽有余。但-20 oC 放置一至數小時,可回收幾乎所有的RNA。如需盡可能多的RNA,或起始組織細胞的量很少,或用戶需要暫停操作時,可以這樣做。用更低的溫度和更長的時間進行沉淀并不必要。
4. 離心, 12,000g,4 oC,10分鐘。小心棄上清,管底可見少許黃白色RNA沉淀。如初始組織細胞量少,RNA沉淀用肉眼幾乎難辨,但不影響實驗。
5. 洗滌沉淀。立即加入1 ml 75%乙醇,顛倒混勻數次,12,000g 5分鐘。棄上清,盡量吸去管壁上的液體。乙醇洗滌后RNA沉淀容易漂浮,勿倒掉RNA沉淀。此時可將RNA沉淀保存在75%乙醇中,4 oC一周或-20 oC一年。
6. 敞開管口空氣干燥5-10分鐘,RNA沉淀干燥至膠凍狀即可。過分干燥將使RNA難以溶解。用50-100 ml DEPC處理的高壓消毒純水或TE溶解沉淀。如RNA難溶,可55 oC加熱10分鐘,或反復凍融數次助溶。RNA溶液可保存于-70 oC或液氮中;或加3倍體積乙醇-20 oC凍存,用時離心沉淀。
7. 測定OD值。計算RNA濃度和OD260/280比值。RNAtrip LS提取的RNA絕少蛋白污染,比值通常在1.6-2.0之間均屬正常。OD260/280比值受很多因素影響。起始組織量過大或RNAtrip LS試劑過少,或吸取了有機相或碎片,將使OD260/280比值降低,應預以避免;RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低,而用TE或離子強度較高的溶液溶解時該比值較高,但均不影響RNA使用。用戶應該知道,即便是已降解的RNA,該比值也能達到看似完-美的2.0左右,因此該比值并非判斷RNA降解與否的指標。可進行RNA瓊脂糖電泳檢查RNA完整性(見說明2)。