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加強型RIPA裂解液實驗技巧

發布時間: 2023-01-05  點擊次數: 464次

加強型RIPA裂解液實驗技巧

 

描述: 加強型RIPA裂解液加強型對動物細胞胞膜、胞漿、胞核成分有較強裂解作用,是常用的細胞組織快速裂解液。使用加強型RIPA 裂解液特別適于提取膜蛋白以及western blot和大多數蛋白-蛋白相互作用的實驗等。


儲存:
4 ℃保存 12個月有效


規格:
100ml  500ml


制備細胞裂解產物
1. 800g4℃離心5分鐘收集培養細胞,估計細胞離心后的體積(PCV,106cells=~20ul,107cells =~100ulPCV);
2. 每50-100ulPCV加入5倍體積RIPA裂解緩沖液(250-500ul),冰浴中放置10分鐘,并每隔5分鐘在漩渦混合儀上振蕩30秒;
3. 12000g4℃離心10分鐘,將上清轉移到新的離心管中,即得細胞總蛋白產物;
4. 假如所得蛋白產物較為粘稠,95℃加熱5分鐘,然后迅速冰浴5分鐘,12000g4℃離心10分鐘,將上清轉移到新的離心管中,即得細胞總蛋白產物。


制備組織裂解產物
1. 取50-100mg組織在冰上剪成碎片,用預冷的PBS洗滌2次離心棄去PBS;
2. 加入0.5-1ml預冷RIPA裂解緩沖液;
3. 4℃用玻璃勻漿器勻漿20-40次,直到95%的細胞被破碎,然后在冰浴中放置10分鐘,并每隔5分鐘在漩渦混合儀上振蕩30秒;
4. 12000g4℃離心10分鐘,將上清轉移到新的離心管中,即得組織總蛋白產物;
5. 假如所得蛋白產物較為粘稠,95℃加熱5分鐘,然后迅速冰浴5分鐘,12000g4℃離心10分鐘,將上清轉移到新的離心管中,即得組織總蛋白產物;
6. 20%的甘油保存于-70oC或-20oC。


注意:
1. 在轉移上清液時不要吸入底部的沉淀物;
2. 在做免疫沉淀或免疫共沉淀時最好在實驗前進行蛋白的提取,以避免某些不穩定蛋白的降解;
3. 在該RIPA裂解緩沖液中未加入蛋白酶抑制劑。

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