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Western Blot中關于抗體的相關問題!

發布時間: 2018-12-03  點擊次數: 710次

Western Blot中關于抗體的相關問題!

 

1、做細胞信號傳導,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?

解答:對二抗無要求,要看你實驗條件來選擇,一般用HRP標記的二抗。

2、同一公司的不同抗體用某個稀釋度對一種抗體效果好,另外一種抗體可不可以用同種稀釋度進行稀釋?
解答:不同抗體,即使是同一公司的抗體,其*的抗體稀釋度也是不一樣的,需要進行實驗摸索。

 

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3、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?
解答:免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。(限于單抗)

4、Western Blot 中抗體的重復應用問題
解答:抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用2-3次。稀釋后應在2-3天內使用,4℃保存,避免反復凍融。

5、做western每次只加一種一抗,可以同時加兩種或者多種一抗的嗎?
解答:還是不要同時加兩種一抗。因為如果結果里面有非特異信號的話,就說不清楚了。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL顯色、壓片、洗片;漂洗以后,再上內對照的一抗、二抗,ECL顯色、壓片、洗片。 

6、酶顯色與熒光顯色之間,各自的優缺點是什么?
解答:免疫酶技術就是用酶(如辣根過氧化物酶)標記已知抗體(或抗原),然后與組織標本在一定條件下反應,如果組織中含有相應抗原(或抗體),抗原抗體相互結合形成的復合物中所帶酶分子遇到底物時,能催化底物水解、氧化或還原,產生顯色反應,這樣就可以識別出標本抗原(抗體)分布的位置和性質,通過圖像分析并可達到定量的目的。

免疫熒光技術雖已廣泛應用于免疫學的研究與診斷,但是熒光抗體染色標本不能保存,對組織細胞的細微結構分辨不清,免疫酶技術則能克服上述不足,標記免疫酶技術的敏感性更優于免疫熒光法,對石蠟切片標本尤為適用,為免疫病理研究開辟了一條新途徑,酶顯色產物具有較高的電子密度,經過適當處理還可以進行免疫電鏡觀察,免疫酶組化技術分為酶標記法與非標記抗體技術,前者是將酶通過交聯劑結合在抗體分子上,形成酶標記抗體。后者是將酶作為抗原與相應的特異性抗體連接進行的免疫反應,稱為非標記抗體酶技術。

 

Western Blot中關于抗體的相關問題!

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