明膠酶譜法檢測試劑盒染色的小技巧
基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白,又稱膠原酶。通過影響細胞外基質(zhì),膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程,并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程,其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,其靈敏度可達1 nM,高于ELISA方法,其基本原理1和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳,電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮區(qū)域,從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液,可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性,檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行50次標準小膠檢測,如果小膠加樣孔為10~15個,則總計可檢測500~750個樣品。
染色步驟:
1. 此染色液即為工作液,使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝
膠,并緩慢搖動2h;
2. 傾去染色液,用脫色液沖洗凝膠;
3. 以脫色液覆蓋凝膠,緩慢搖動2h,傾去脫色液,再加入新脫色液進行脫色,直至獲得清晰的藍色的條帶
和干凈的背景(通常此過程需要2~4h,也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景);
4. 對凝膠進行分析和照相,凝膠可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置(P2000)對
凝膠進行處理后保存。
安全性:含有甲醇,無特殊毒性,按一般化學品操作規(guī)程處理。
說明:
1. 染色液配方:0.25g 考馬斯亮藍R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸,定容至1000ml,混合1h 后用
Whatman 1 號濾紙過濾,于室溫可無限期保存;
2. 脫色液配方:冰醋酸:甲醇:水=7:5:88(V:V:V);
3. 保存液:7%冰醋酸;
4. 凝膠染色之后,染色液可以回收利用,裝入新容器內(nèi),室溫或4 oC 保存,可反復使用2-4 次。