活死細(xì)胞染色試劑盒是Calcein-AM和PI 的雙重染料

產(chǎn)品說明：
Calcein-AM 是一種對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490nm, Em=515nm）。因其在傳統(tǒng)的 Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子 Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑（如 BCECF-AM 和 CFDA)相比，由于 Calcein, AM 細(xì)胞毒性極低，適合用于活細(xì)胞染色的熒光探針，而且不會(huì)抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。
 

由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein-AM 僅用于對活細(xì)胞的細(xì)胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此，
Calcein-AM 常常與死細(xì)胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯(lián)合使用，同時(shí)進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光
雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，僅能穿過死細(xì)胞膜的無序
區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的 DNA 雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此
PI 僅對死細(xì)胞染色。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活
細(xì)胞和死細(xì)胞。而用 545 nm 激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。
 

本試劑盒的工作原理就在于 Calcein-AM 和 PI 的雙重染料，來進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色
標(biāo)記，從而進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)體系，單次就 200µl 細(xì)胞懸液進(jìn)
行染色，可以做 500 次檢測。

染色步驟
2.1 對于貼壁細(xì)胞，先用細(xì)胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化細(xì)胞，之后離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3min）。
對于懸浮細(xì)胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細(xì)胞。
2.2 去上清，用 1×Assay Buffer 充分清洗細(xì)胞 2~3 次，以充分去除殘留的酯酶活性。
2.3 用 1×Assay Buffer 制備細(xì)胞懸液，使其密度為 1×105~1×106細(xì)胞/ml。
2.4 取 100µl 染色工作液加入 200µl 細(xì)胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育 15min。
注意：如果需要，可延長孵育時(shí)間至 30min。
2.5 熒光顯微鏡下使用 490±10 nm 激發(fā)濾片同時(shí)檢測活細(xì)胞（黃綠色熒光）以及死細(xì)胞（紅色熒光）。
另外，使用 545nm 的發(fā)射濾片僅能觀察到死細(xì)胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進(jìn)行
檢測。
注意：可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料的工作濃度。
a) 用 0.1%皂素或者 0.1-0.5%孵育細(xì)胞 10min，或者用 70%乙醇孵育細(xì)胞 30min，從而制備死
細(xì)胞；
b) 用 0.1-10µM 的 PI 溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅僅對細(xì)胞核染色，而不會(huì)對細(xì)胞質(zhì)染色的
工作濃度。
c) 用 0.1-10µM 的 Calcein-AM 進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到不會(huì)對細(xì)胞質(zhì)染色的工作濃度。然后用
此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色，去觀察是否活細(xì)胞能被染色。
注意事項(xiàng)：
1）由于 Calcein-AM 對濕度非常敏感，若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋
子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM 工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。
2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時(shí)一定要注意防護(hù)。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清
洗。
3）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。