抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的操作步驟
抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)是破骨細胞的標志性酶,特異性分布于破骨細胞中。TRAP染色試劑盒即是用于顯示組織中的破骨細胞。其中基本原理在于,在含酒石酸的酸性條件下,抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP能將萘酚AS-BI磷酸鹽水解,產生的萘酚AS-BI與六偶氮副品紅結合,形成非水溶性的酒紅色物質沉積在酶活性原位,從而實現對抗酒石酸酸性磷酸酶的顯色和定位。本產品基本組成成分:反應緩沖液主要成分為醋酸緩沖液及酒石酸鉀鈉,pH約5.0;副品紅溶液,含5%副品紅;亞硝酸鈉溶液主要成分為4%亞硝酸鈉;AS-BI磷酸鹽底物溶液,主要成分為20 mg/mL萘酚AS-BI磷酸鹽。經本產品染色后,破骨細胞中的TRAP呈酒紅色,定位于細胞漿。按照切片上每個組織點300 μL用量,本試劑盒可以做50次以上TRAP染色。
儲存與運輸:冰袋(wet ice)運輸;2-8℃避光保存,其中AS-BI磷酸鹽底物溶液-20℃保存,有效期12個月。
配制TRAP工作液:
(1)取50 μL副品紅溶液(G1050-2)與50 μL亞硝酸鈉溶液(G1050-3)在潔凈離心管中混勻,得到六偶氮副品紅溶液;
(2)向第1步的100 μL六偶氮副品紅溶液中加入100 μL AS-BI磷酸鹽底物溶液(G1050-4),吹吸數次充分;
(3)吸取1.8 mL反應緩沖液(G1050-1)加入到第2步的混合液中充分混勻;
(4)第3步的混合液經針式濾器過濾(0.45 μm水系濾膜)即得到TRAP工作液。
注意:務必按照所屬順序配制工作液。每個組織點大約需要200-300 μL工作液,根據使用量配制,現配現用,避免浪費。
石蠟切片操作步驟(供參考)
1. 石蠟切片脫蠟至水,純水洗數分鐘。
2. 將切片用組化筆化圈后放在(加有一定量的防止切片蒸干的純水)濕盒中,用純水37℃孵育2 h。
3. 切片孵育完成后傾去純水,滴加過濾好的TRAP工作液覆蓋組織,置于37℃避光反應20-30 min。
4. 復染細胞核:傾去孵育液并水洗,以蘇木素染液進行染核。
5. 脫水,透明,以中性樹膠封片。
細胞爬片操作步驟(供參考)
1. 細胞固定:吸除細胞培養液,加入4%多聚醛固定15-30 min,蒸餾水洗3次。
2. 細胞破膜:以0.2% Triton X-100溶液覆蓋細胞進行破膜處理20-30 min,蒸餾水輕洗3遍。
3. 孵育染色:將TRAP工作液加到細胞孔板內覆蓋細胞,37℃避光孵育20 min,蒸餾水洗3次。
4. 細胞核復染:吸除孵育液并水洗,以蘇木素染液進行染核。
5. 加入適量無水乙醇脫水,取出孔板中的蓋玻片,吹風機吹干,倒扣在潔凈的載玻片上以中性樹膠封片。
實驗流程:脫蠟至水—染液配制-Trap染色-蘇木素淺染核-脫水封片-顯微鏡鏡檢
結果判讀:破骨細胞呈酒紅色或淺紅色,細胞核呈淺藍色
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的操作步驟