小鼠白細胞介素10試劑盒的操作方法
白介素10是一種多細胞源、多功能的細胞因子 ,調節細胞的生長與分化,參與炎性反應和免疫反應,是目前炎癥與免疫抑制因子。在腫瘤、感染、造血系統及心血管系統中發揮重要作用 ,與血液、消化、尤其是心血管系統疾病密切相關。
在1989年,Mosmannand及他們的同事描述了一種新的免疫介質,由Th2細胞克隆分泌,能夠抑制Th1細胞克隆IL-2和IFNr的合成。早期被命名為細胞因子合成抑制因子(CSIF),這種因子后來被命名為IL-10,在這被發現的21年期間,很多研究深入剖析了這個細胞因子的生物學特性。
細胞的來源:
目前已知并非只有特定的T細胞亞群才能合成IL-10,幾乎所有淋巴細胞均能合成IL-10。體內最重要的來源主要是單核巨噬細胞和T輔助細胞,此外,樹突狀細胞,B細胞,細胞毒性T細胞,γδT細胞,NK細胞,肥大細胞以及中性粒細胞和嗜酸性細胞也能合成IL-10,這些細胞分泌IL-10主要決定于特定的刺激,受損組織類型和某種免疫反應時間點。
單核巨噬細胞在各種內源性和外源性介質的作用下激活后分泌IL-10,如LPS(通過激活TLR4,TRAF3,NF-κBp65/p50,和ERK激酶)、兒茶酚胺(通過激活蛋白激酶A和CREB-1/ATF-1)引起IL-10基因轉錄。單核巨噬細胞在清除凋亡細胞過程中也會分泌IL-10,這一過程依賴于CD36和p38絲裂原激活蛋白(MAP)激酶,除了轉錄水平,等最近認為IL-10也被microRNA在轉錄后期所調節。
操作步驟:
1. 標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
1000pg/ml 5 號標準品150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
500pg/ml 4 號標準品150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
250pg/ml 3 號標準品150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
125pg/ml 2 號標準品150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
62.5pg/ml 1 號標準品150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待
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測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl, 然
后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不
觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液:將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此
重復5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同3。
8. 洗滌:操作同5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
11. 測定:以空白空調零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。測定應在加終止液
后15 分鐘以內進行。