正確認(rèn)識糞大腸菌群

1.糞大腸菌群
糞大腸菌群作為地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)唯-一的一項(xiàng)微生物監(jiān)測指標(biāo)，我國多用多 管發(fā)酵法進(jìn)行檢測，近幾年也更新了好幾個相關(guān)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。

糞大腸菌群是總大腸菌群中的一部分，用來表明水質(zhì)受污染的程度，主要來自糞便。糞大腸菌群是一類能使乳糖發(fā)酵、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在44.5 ℃培養(yǎng)24~48ｈ能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。
通過對糞大腸菌群的監(jiān)測，可了解水體受生活污水污染的狀況。糞大腸菌群適 用于河流、湖泊等地表水、企業(yè)污水及醫(yī)院廢水的監(jiān)測，是綜合評價(jià)城 鎮(zhèn)污水，尤其是生活污水污染的一個*的重要指標(biāo)。


２ 樣品的采集和保存
2.1 樣品采集
采樣人員大多缺乏細(xì)菌學(xué)監(jiān)測知識，出現(xiàn)很多采樣不規(guī)范的現(xiàn)象。如：微生物項(xiàng)目水樣和理化水樣混采；滅菌瓶開蓋時間過早、水樣在空氣中暴露 時 間 過 長；水樣采集量過滿（既容易導(dǎo)致水樣中細(xì)菌缺氧死亡，又不利于水樣檢測前振蕩搖勻）；微生物樣品和其他理化項(xiàng)目同時采樣時，沒有做到細(xì)菌樣品優(yōu)先采集；采樣人員在采集樣品時，沒注意避免采樣瓶受雜菌污染（手接觸到瓶蓋和瓶頸、采樣設(shè)備不規(guī)范）。
2.2 采樣瓶的準(zhǔn)備和存放
采集糞大腸菌群的采樣瓶需要用牛皮紙封包好后，再經(jīng)過高壓滅菌器滅菌才能使用。滅菌后的采樣瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。有條件的單位，也可以使用無菌采樣瓶。滅菌后的采樣瓶也有其保存期，超過兩周內(nèi)未使用就必須重新滅菌。絕大部分實(shí)驗(yàn)室都是在*滅菌后不再管其使用期 限。采樣瓶存放過久可能受到雜菌污染。
2.3 樣品運(yùn)輸保存
在樣品的運(yùn)輸和保存過程中，樣品的冷藏是關(guān)鍵（溫度過高過低都不利于樣品的保存）。由于儀器設(shè)備條件不夠，運(yùn)輸過程不滿足樣品所需溫度或者路途遙遠(yuǎn)，送檢時間超過６ｈ，都會導(dǎo)致樣品失效。樣品交接時間過長（在樣品送入實(shí)驗(yàn)室之后，采樣人員要將采樣記錄移交給業(yè)務(wù)室，然后由接樣員對水樣進(jìn)行編號并將檢測任務(wù)下發(fā)到監(jiān)測室），導(dǎo)致樣品沒有及時分析而超過時限。特別是，在執(zhí)法監(jiān)測和污染源監(jiān)督性監(jiān)測中，需要的采樣時間長，有時還需 要 分 時 間 段 監(jiān) 測，這過程很容易造成樣品超時。并且，樣品保存時間越長越不能保證樣品在合格的冷藏溫度下。這幾年，經(jīng)常出現(xiàn)企業(yè)和監(jiān)測機(jī)構(gòu)因該項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)的特殊性發(fā)生糾紛。建議在采集細(xì)菌樣時，車上安裝車載冰箱、冷藏箱或者其他冷藏設(shè)備，可以實(shí)時監(jiān)測溫度。加入冰塊保存時，樣品不可以直接接觸冰塊。不能保證樣品在有效期內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室分析時，可以考慮使用剛剛出臺的酶底物法（HJ1001-2018）進(jìn)行現(xiàn)場檢驗(yàn)。
３ 實(shí)驗(yàn)室分析
3.1 試劑質(zhì)量
3.1.1 培養(yǎng)基
培養(yǎng)基的質(zhì)量是整個實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果的保障，是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。分 析人員可能認(rèn)為只要培養(yǎng)基在保質(zhì)期內(nèi)，都是合格的，而忽略了對培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量控制。

培養(yǎng)基需在濕度低、溫度不超過３０ ℃的房間避光保存，避免雜菌侵入。配置前，應(yīng)該觀察培養(yǎng)基顏色和體積，變化明顯時廢棄不用。配好的培養(yǎng)基需要在２ｈ內(nèi)進(jìn)行高壓滅菌；對于不能及時滅菌的培養(yǎng)基，可以在冰箱內(nèi)存放且不超過一天，因?yàn)闇缇患皶r，就會影響其殺菌效果和營養(yǎng)成份的含量。培養(yǎng)基滅 菌結(jié)束后應(yīng)迅速冷卻，避免長時間保存在滅菌鍋內(nèi)，容易造成滅菌過度從而影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。配置的培養(yǎng)基不宜存放過久，堅(jiān)持多配少量的原則，盡 量在一周內(nèi)用完為好。每批培養(yǎng)基在使用前，都應(yīng)對培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量鑒定，只有經(jīng)過驗(yàn)證合格的培養(yǎng)基，才能投入使用。

3.1.2無菌水
目前很多實(shí)驗(yàn)室采用先配置所需量的稀釋水到試管中再統(tǒng)一滅菌。在實(shí)驗(yàn)分析時發(fā)現(xiàn)由于稀釋水在高壓滅菌和冰箱存放這一系列過程中揮發(fā)，導(dǎo)致稀釋水在做樣時達(dá)不到所需的量。建議先用大容量玻璃瓶統(tǒng)一準(zhǔn)備足量的無菌水和100ｍL的量筒，使用時在無菌環(huán)境下按所需量進(jìn)行分裝。無菌水的配制盡量在當(dāng)天或?qū)嶒?yàn)前一天配置，-好實(shí)驗(yàn)當(dāng)天進(jìn)行配制。無菌水需要調(diào)pH值、可在常溫保存。

3.2 操作方法
3.2.1 稀釋倍數(shù)  
有時候，企業(yè)污水、醫(yī)療廢水等糞大腸菌群污染嚴(yán)重的水樣需要稀釋到10-4～10-5ｇ／mL之后接種，但分析人員不能準(zhǔn)確判斷其大致稀釋倍數(shù)，容易出現(xiàn)超出或者低于定量范圍。現(xiàn)行的環(huán)境監(jiān)測分析方法與有關(guān)技術(shù)規(guī)范中糞大腸菌群檢數(shù)表里所列的幾個不定值（“＜”或“＞”）給監(jiān)測工作帶來一定的困難。能否選擇出正確的稀釋度是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

接種的稀釋比，為了避免在實(shí) 測 數(shù) 據(jù) 中 出 現(xiàn) 不 定值，實(shí)驗(yàn)分析人員應(yīng)充分了解自己所做區(qū)域各種水樣的稀釋比，根據(jù)待檢水樣的環(huán)境因素和水樣性質(zhì)確定合適的稀釋比。采樣人員盡量將樣品性質(zhì)、受污染程度在采樣記錄上描述清楚，以供分析人員選擇合適的分析方法。對于不確定稀釋范圍的水樣，可以進(jìn)行多種梯度稀釋。

3.2.2 結(jié)果判讀
在使用多管發(fā)酵法測試時，如果在初發(fā)酵試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣，可以適當(dāng)?shù)匮娱L培養(yǎng)時間到48ｈ。

在使用酶底物法測試時，在培養(yǎng)24ｈ后結(jié)果為可疑陽性或者無顏色反應(yīng)，可 適 當(dāng) 延 長 培 養(yǎng) 時 間 到28ｈ進(jìn)行結(jié)果判讀，超過28ｈ之后出現(xiàn)的 顏 色 反 應(yīng) 不 作 為陽性結(jié)果。如果樣品有背景顏色，需做一個空白試驗(yàn)，與標(biāo)準(zhǔn)盤作比較。如果加入培養(yǎng)基，樣品顏色過深，可能是余氯過多或者pH值過低的原因，這種方法就不適用了。

４ 質(zhì)量控制
4.1 空白和平行性

以前使用的多管發(fā)酵法、濾膜法等對空白和平行性沒有明確的要求。大部分實(shí) 驗(yàn)室也于對每批樣進(jìn)行空白測定。

無論用哪種方法檢測，建議每個月要對實(shí)驗(yàn)室用水做質(zhì)量檢測，每批樣品要用無菌水做全程序空白和實(shí)驗(yàn)室空白測定，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。使用酶底物法分析時，對20個樣品或每批次樣品測定一個平行雙樣。
4.2 質(zhì)控措施
糞大腸菌群項(xiàng)目的監(jiān)測起步比較早，但是之前一直作為非標(biāo)項(xiàng)目，糞大腸菌群的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株也是在近兩年才興起。大部分實(shí)驗(yàn)室分析人員之前沒有接觸過 質(zhì)控，也沒有接受過這方面知識的培訓(xùn)，在近兩年密碼樣考核和實(shí)驗(yàn)室間比對中，該項(xiàng)目的效果不是很好。

目前國內(nèi)使用的有證標(biāo)準(zhǔn)菌株幾乎都是從國外購買的，價(jià)格貴、購買渠道復(fù)雜且不易保存。國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室很少有達(dá)到對每批樣品 使 用 有 證 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株 進(jìn) 行 陽 性、陰性對照試驗(yàn)。微生物的質(zhì)控、盲樣制作難度較大，影響了國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室關(guān)于微生物方面質(zhì)量控制的開展。盡管如此，各個實(shí)驗(yàn)室也應(yīng)該盡量做到，定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陰陽性對照試驗(yàn)。酶底物法要求，每年至少必須進(jìn)行６次定量試驗(yàn)、４次定性試驗(yàn)