谷氨酸合成酶(GOGAT)檢測試劑盒測定意義
產品說明:
GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非綠色組織的前質體中,和谷氨酰胺合成酶(GS)共同構成 GS/GOGAT 循環,參與氨同化的調控。GOGAT 以 NADH 為電子供體,催化谷氨酰胺的氨基轉移到α-酮戊二酸形成兩分子的谷氨酸,NADH 在 340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。
測定意義:GOGAT分布于植物中,和谷氨酰胺合成酶共同構成GS/GOGAT循環,參與氨同化的調控。
測定原理:GOGAT催化谷氨酰胺的氨基轉移到α-酮戊二酸,形成兩分子的谷氨酸;同時NADH氧化生成NAD+,340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。
試驗中所需的儀器和試劑:
紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、粗酶液提取:細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次);10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入1mL 提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
二、測定步驟:
1、紫外分光光度計預熱 30min 以上,調節波長至 340nm,蒸餾水調零。
2、工作液提前配置,平衡至室溫。
注意事項:
1、測定期間樣本在冰上放置,以免變性和失活。
2、盡量兩個人同時做此實驗,一個人比色,一個人計時,以保證實驗結果的準確性。
3、當 A1 大于 1.5 或者?A 大于 0.6 時,建議將樣品用蒸餾水稀釋后測定,當?A 過小時,可以延長酶促反應時間(10min 或 15min)或者加大加入的樣品體積進行測量。
4、由于提取液中含有一定濃度的蛋白(約 1mg/mL),所以在測定樣品蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量
谷氨酸合成酶(GOGAT)檢測試劑盒測定意義