質(zhì)粒是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌

細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸分子。現(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細(xì)胞核或擬核中的 DNA 以外的DNA 分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細(xì)菌的染色體，也能從整合位置上切離下來(lái)成為游離于染色體外的 DNA 分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制。(Vector)(DNA)

目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌質(zhì)粒都是共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA 分子(簡(jiǎn)稱 cccDNA)。細(xì)菌質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的 0.5%～3%。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對(duì)分子質(zhì)量是 40×10⁶ 以上，較小一類的相對(duì)分子質(zhì)量是 10×10⁶ 以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對(duì)分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí)，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1～2個(gè)質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有 20 個(gè)左右質(zhì)粒。這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個(gè)細(xì)胞中含有 10-200 份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還會(huì)使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。

質(zhì)粒提取原理

現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒（＞15Kb）。

堿裂解法是一種廣泛使用的制備質(zhì)粒 DNA 的方法。其原理為：染色體 DNA 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒 DNA，染色體 DNA 為線狀分子，而質(zhì)粒為共價(jià)閉合環(huán)狀分子。當(dāng) pH 12.0-12.6 堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體 DNA *變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒 DNA 在將 PH 調(diào)至中性后即可以恢復(fù)其天然構(gòu)象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體 DNA 和蛋白質(zhì)在去污劑 SDS 的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒 DNA 仍為可溶狀態(tài)，通過(guò)離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體 DNA、RNA 及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒 DNA 仍在上清中。

質(zhì)粒提取常見(jiàn)問(wèn)題分析

1、影響質(zhì)粒提取的因素有哪些？

質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān)，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)菌細(xì)胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。

2、為什么從革蘭氏陽(yáng)性菌中提取質(zhì)粒要在懸浮液中加入溶菌酶？

革蘭氏陽(yáng)性菌有一層細(xì)胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。

3、如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇不同級(jí)別的產(chǎn)品？

從純度上：各種常規(guī)操作,包括酶切、PCR、測(cè)序、文庫(kù)篩選、連接和轉(zhuǎn)化，普通純度的質(zhì)粒可以滿足要求；而對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，則要求使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒方能滿足要求。

從提取的量上：1-20μg，應(yīng)選擇小量提取試劑盒；20-40μg，應(yīng)選擇中量提取試劑盒；大于 40μg，應(yīng)選擇大量提取試劑盒。

從宿主菌上：分為普通細(xì)菌質(zhì)粒提取試劑盒、G+菌質(zhì)粒提取試劑盒和酵母菌質(zhì)粒提取試劑盒，根據(jù)情況進(jìn)行選擇。

■ 未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低：

△ 大腸桿菌老化

請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。

△ 質(zhì)粒拷貝數(shù)低

由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒 DNA 提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。

△ 菌體中無(wú)質(zhì)粒

有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

△ 堿裂解不充分

使用過(guò)多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液 1、2 和 3 的用量。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)，可加倍使用溶液 1、2 和 3，可能有助于增加質(zhì)粒提取量和質(zhì)粒質(zhì)量。

△ 溶液使用不當(dāng)

溶液 2、3 在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于 37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。

△ 吸附柱過(guò)載

不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如 TB 或 2×YT，菌液體積必須減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長(zhǎng)率，則需調(diào)整 LB 培養(yǎng)液體積。

△ 質(zhì)粒未全部溶解（尤其質(zhì)粒較大時(shí)）

洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。

△ 乙醇?xì)埩?/span>

漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，樹(shù)脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹(shù)脂，再加入洗脫緩沖液。

△ 洗脫液加入位置不正確

洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)*覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到大洗脫效率。

△ 洗脫液不合適

DNA 只在適當(dāng) pH 值的低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液 TE (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水；洗脫效率取決于 pH 值。大洗脫效率在 pH 7.0–8.5 間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其 pH 值在此范圍內(nèi)，如果 pH 過(guò)低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使更用有利于提高洗脫效率。

△ 洗脫體積太小

洗脫體積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

△ 洗脫時(shí)間過(guò)短

洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)放置一分鐘可達(dá)到較好的效果。

■ 質(zhì)粒質(zhì)量不高：

△ 混有蛋白

不要使用過(guò)多菌體。溶液 1、2、3 處理并離心后溶液應(yīng)為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物，可再次離心去除后再進(jìn)行下一步驟。 △ 混有 RNARNase A 處理不*，請(qǐng)減少菌體用量或加入溶液 3 之后室溫放置一段時(shí)間。如果溶液 1 已保存 6 個(gè)月以上，請(qǐng)?jiān)谌芤?/span> 1 中添加 RNaseA。

△ 混有基因組 DNA

加入溶液 2 和 3 后應(yīng)溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組 DNA 剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。如果加入溶液 2 后過(guò)于粘稠，無(wú)法溫和混勻，請(qǐng)減少菌體用量。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和 DNA 的降解，不要超過(guò) 16 小時(shí)。

△溶液 3 加入時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

溶液 3 加入后，放置時(shí)間不要太長(zhǎng)，否則有可能會(huì)產(chǎn)生小片段 DNA 污染。

△ 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在質(zhì)粒提取過(guò)程中降解質(zhì)粒 DNA，影響提取質(zhì)粒 DNA 的完整性，選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和 *0。

△ 裂解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

加入溶液 2 后裂解時(shí)間不應(yīng)超過(guò) 5 分鐘。

△ 質(zhì)粒的二聚體和多聚體形式

質(zhì)粒復(fù)制過(guò)程中形成的，與宿主菌相關(guān)，電泳可檢測(cè)出。